Insémination Artificielle : la préparation des doses de congélation
11 Fabrication des dilueurs
12 Pour exemple : fabrication du dilueur de base (lait + antibiotiques)
13 Fabrication du dilueur INRA
14 Fabrication du dilueur de Kenney
15 Les 2 dilueurs de congélation (méthode Palmer 84)
2 Préparation des doses de sperme frais
21 Méthode standardisée à 200 millions de spermatozoïdes
22 Méthode sans perte de sperme
23 Microbisme des doses de sperme congelé
Les grands principes à respecter dans la préparation des doses visent :
1_ à préserver le pouvoir fécondant de la semence :
- – raccourcir la durée pendant laquelle la semence reste à 35°C;
- – supprimer l’effet du plasma séminal par dilution (1 volume de sperme pour au moins 2 volumes de dilueur) ou centrifugation avec élimination du surnageant;
- – éviter les chocs thermiques,
2_ apporter une dose nécessaire et suffisante à la jument :
- – un nombre suffisant de spermatozoïdes totaux ( >200 millions en sperme frais ou >400 millions en sperme congelé);
- – un volume de la dose < 20 ml.
1 Les dilueurs
11 Fabrication des dilueurs
111 Rôle des dilueurs
Les dilueurs (de semence fraîche et de semence congelée) ont une composition de base assez semblable leur permettant d’assumer les rôles suivants :
– dilution du plasma séminal (effet du volume);
– diminution de la concentration en spermatozoïdes (effet du volume);
– milieu nutritif (sucres : glucose, lactose…);
– protection des cellules contre le « cold-shock » (lipoprotéines telles que le lait ou le jaune d’œuf et sucres),maintien d’un pH (sels de sodium, potassium, magnésium… ou solutions tampons telles que l’Hepes, TRIS…) et d’une pression osmotique (sels, sucres) proches de celle du sperme pour éviter tout choc;
-limitation du développement bactérien (antibiotiques).
Les dilueurs de congélation contiennent de plus un (ou des ) cryoptotécteur(s) tels que le glycérol permettant la protection des cellules contre les dégâts de la congélation.
112 Choix des dilueurs
Les différents dilueurs sont utilisables suivant les temps de conservation de la semence désirés. En pratique, les dilueurs courants sont le lait 1 :2 écrémé, le dilueur de Kenney, l’INRA 82 et deux dilueurs de congélation
*AB :antibiotiques
113 Choix des antimicrobiens
L’emploi d antibiotiques dans les dilueurs d’insémination est utilisé pour diminuer ou stopper la multiplication des bactéries dans les doses conservées. Les antibiotiques sont inutiles dans les doses utilisées dans les 30 minutes qui suivent la collecte (IA immédiate).
Le choix de l’antibiotique est établi en fonction de deux critères :
- – son absence de toxicité sur les spermatozoïdes;
- – son aptitude à diminuer la contamination microbienne des doses conservées et éventuellement à tuer certains germes pathogènes.
L’association recommandée est la gentamicine 50mg/l et pénicilline G 50000 UI/I). Cette association diminue la concentration en germe d’au moins 10 fois.
114 Le lait et l’eau
Que ce soit pour le dilueur de base ( lait 1/ écrémé + antibiotiques) ou pour les dilueurs plus sophistiqués, ne prendre que du lait UHT pur sans additifs d’aucune sorte (vitamines…). Le lait UHT est stérile, contrairement au lait frais pasteurisé.
A la congélation-décongélation, le lait reste chimiquement de même composition, mais ses propriétés physico_chimiques sont altérées avec précipitation des certaines protéines, déstabilisation de molécules (dont la caséine) aboutissant quelques fois à une séparation du lait en deux phases. De plus les différentes manipulations avant congélation (addition d’antibiotiques, mise en flacon…) contaminent le lait. Donc, il faut éviter la congélation du lait.
La quantité d’eau à choisir est la quantité PPI (Pour Préparation Injectable) : on est ainsi certain de sa grande pureté et de sa stérilité. Tout litre commencé doit être jeté s’il n’est pas utilisé dans la journée.
12 Pour exemple : fabrication du dilueur de base (lait + antibiotiques)
Le temps de préparation est de 5 minutes.
- Nettoyer le haut de la brique avec de l’alcool et laisser sécher.
Essayer d’avoir des seringues sans aucune partie en caoutchouc (spermicide), notamment au bout des pistons. Pour garder le bénéfice des emballages stériles : ouvrir en séparant les feuillets de l’emballage et non en passant la seringue et l’aiguille à travers l’emballage. Changer de seringue et d’aiguille pour chaque antibiotique et pur chaque fabrication.
Pour la pénicilline, injecter la quantité d’eau PPI requise pour la dissolution de la poudre puis prélever avec une seringue à insuline (1ml) la quantité nécessaire de pénicilline, soit ouvrir le flacon avec un décapsuleur et prélever le volume nécessaire avec une pipette automatique.
La gentamicine est prélevée classiquement dans son flacon.
- – Injecter dans la brique la pénicilline dissoute est la gentamicine.
- – Étiqueter la brique en mentionnant la date de fabrication, agiter.
– Ouvrir la brique de dilueur en utilisant des ciseaux passés à l’alcool, verser une fraction du dilueur dans un flacon en verre pour le mettre à température dans le bain-marie. S’arranger pour qu’un volume de dilueur ne reste pas plus de 30 minutes au bain marie (risque sanitaire). Protéger l’ouverture de la brique avec du parafilm et la stocker au réfrigérateur.
- – Stockage : conservation à 4°C : on utilise le dilueur fabriquer le jour même de préférence la veille. On refait donc du dilueur tous les deux jours.
– En cas d’utilisation de milieux congelés :
*stockage pas plus de 2 mois au congélateur dans des flacons bouchés et étiquetés,
*décongélation : la technique al meilleure pour les constituants du lait et les antibiotiques serait une décongélation rapide à l’eau bien chaude, mais pas à plus de 56°C. Proscrire les décongélations lentes ( à cause de la dégradation de la pénicilline en solution) et à température ambiante ou au bain-marie (favorisant les multiplications microbiennes).
Formule du dilueur de base : lait + antibiotiques:
| Lait UHT ½ écrémé | 1 l |
| Gentamicine | 50 mg |
| pénicilline | 50 000 UI |
13 Fabrication du dilueur INRA 82
Le temps de préparation est de 30 à 40 minutes si la pesée est comprise.
- – Commencer par peser le glucose directement dans le bécher de dissolution puis ajouter les autres constituants à sec.
– Ajouter dans le bécher un volume d’eau PPI inférieur a volume total de la dissolution saline. Au moment où l’on verse l’eau, on doit remuer le flacon rapidement pour éviter que le glucose ne prenne en masse. Faire dissoudre à froid sur l’agitateur magnétique. Puis compléter au volume désiré dans une éprouvette. Utiliser un gros aimant pour retenir par l’extérieur le barreau aimanté.
- – Rajouter le volume nécessaire de lait écrémé, puis les antbiotiques.
- – Le pH de la solution finale doit être de 6,8. Après fabrication, il est très souvent un peu en dessous de 6,8. Ajuster le pH si besoin avec de la soude (2N) ou de l’acide chlorhydrique(2N).
– Fractionner et conditionner en indiquant la date de fabrication.
Formule du dilueur INRA 82 hepes 20 mMol/l*
| INRA 82 : 1 volume de solution saline + 1volume de lait écrémé |
Formule de la solution saline :
| Glucose anhydre C6H12O6 | 25 g | 50 g | 100 g | 250 g |
| Lactose à 1 mol. d’eau
C12H22O11, H2O |
1,5 g | 3 g | 6 g | 1,5 g |
| Raffinose à 5 mol. d’eau
C18H32O16, H2O |
1,5 g | 3 g | 6 g | 15 g |
| Citrate de Na à 5,5 mol. d’eau
Na3C6H5O7, 5,5 H2O Ou Citrate de Na à 2 mol. d’eau Na3C6H5O7, 2 H2O |
0,3 g
ou
0,25 g |
0,6 g
ou
0,49 g |
1,2 g
ou
1 g |
3 g
ou
2,5 g |
| Citrate de K à 1 mol d’eau
K3C6H5O7, H2O |
0,41 g | 0 ,82 g | 1,64 g | 4,1 g |
| Hepes (tampon)*
C8H18N2O4S |
4,76 g | 9,52 g | 19 ,04 g | 47,6 g |
| Eau PPI** | QSP 0,5 l | QSP 1 l | QSP 2 l | QSP5 l |
Addition du lait
| Lait UHT écrémé | 0,5 l | 1 l | 2l | 5l |
| Volume total INRA 82 | 1 l | 2 l | 4l | 10 l |
*uniquement en cas de fabrication des dilueurs de congélation
**PPI : Préparation Pour Injectable
14 Fabrication du dilueur de Kenney
Il a été choisi la formule d’origine : elle est très simple, le pH n’est pas ajusté :
Lait en poudre 24 g
Glucose 4,9 g
Eau stérile QSP 1 litre
On peut encore simplifier la fabrication :
- – Par l’utilisation de soluté isotonique glucosé qui présente deux avantages : une pesée en moins et une eau de qualité PPI,
- – Par l’adaptation de la formule pour que l’on ait juste à peser le lait en poudre et à le mélanger à des volumes standards de soluté sans avoir à faire d’ajustement de volume.
Le temps de préparation est de 5 à 10 minutes si la pesée est comprise dans ce temps de préparation. Utiliser les antibiotiques habituels. Le pH sera d’environ 6,6.
Formule du dilueur de Kenney
(Préparation simplifiée par l’utilisation de glucose isotonique)
| Lait écrémé en poudre Regilait | 6,1 g | 12,2 g | 24,4 g | 48,8 g |
| Soluté isotonique de glucose (5%) Meram | 250 ml | 500 ml | 1 l | 2 l |
| Volume total une fois la poudre de lait dissoute | 255 ml | 509 ml | 1,018 l | 2,036 l |
15 Les 2 dilueurs de congélation (méthode Palmer 84)
Le temps de préparation est d’1 heure 30 minute, une fois que l’INRA 82-Hepes est préparé.
Le matériel utilisé sera stérile, la fabrication sera réalisée à température ambiante mais pour éviter les prolifération bactériennes, le dilueur pendant les phases d’attente sera stocké à 4°C. En moyenne, il faut compter deux volumes de premier dilueur pour un volume de second dilueur.
- – Fabriquer du dilueur INRA 82 avec HEPES (20 mMole) (par exemple 2 litres) avec antibiotiques et sans ajuster le pH.
1er dilueur à 2% de jaune d’œuf centrifugé :
Pour 4 litres d’INRA 82-Hepes se trouvant dans un grand bécher, en lever du grand bécher 80 ml (2%) d’INRA-Hepes et le jeter.
Prendre 80 ml d’INRA 82-Hepes et le mettre dans un petit bécher sur l’agitateur.
Préparer un volume de jaune d’œuf correspondant à 2,5% (100 ml) : on peut récupérer environ 10 ml de jaune par œuf de 50 à 60 g. Séparer le jaune du blanc ( de préférence avec une cuillère spéciale (plus ^propre)) en essayant d’éliminer le blanc au maximum. Poser le jaune sur du sopalin et le faire rouler doucement de gauche à droite pour le nettoyer le plus possible. Mettre le jaune au bord d’un papier d’aluminium, puis le plier en deux et piquer le jaune se trouvant au fond du pli avec un cône, tout le jaune s’écoule doucement en laissant la membre dans le pli. La mesure du volume du jaune s’effectue à la seringue graduée ou sur une balance (1 ml= environ 1 g).
Mélanger dans le petit bécher les 100 ml de jaune d’œuf et les 80 ml de milieu au moins 10 minutes à l’agitateur. Répartir 180 ml obtenus dans 4 tubes Corning (4 * 45ml) et centrifuger à 600 g pendant 10 minutes. Reprendre le surnageant en laissant 5 ml de culot au fond de chaque tube. On obtient alors 160 ml (80 ml d’INRA 82-Hepes et 80 ml de jaune d’œuf centrifugé) que l’on verse dans un grand bécher.
Mélanger le tout à froid sur l’agitateur magnétique au minimum ¼ heure pour 2 litres.
Le pH de la solution finale doit être de 6,8. En principe, le dilueur 2% jaune d’œuf centrifugé est inférieur ou égal à ce pH. Ajuster le pH si besoin avec de la soude 2N ou de l’acide chloridrique 2N. puis fractionner et conditionner en indiquant la date de fabrication.
Le 2ème dilueur à 2% de jaune d’œuf centrifugé et à 2,5% de glycérol :
Faire réchauffer le glycérol au bain-marie (se manipulera mieux car sera plus fluide). Mettre le volume de glycérol correspondant à 2,5% du volume du 2ème dilueur dans un petit bécher et le mélanger dans un petit volume de dilueur sur l’agitateur. Le glycérol, très épais, se manipule soit avec une pipette de verre et une poire, soit avec une seringue ( assez précis) après avoir versé dans un bécher. Comme précédemment : enlever le volume apport é par le glycérol et verser le contenu du petit bécher dans le grand, agiter. Puis fractionner et conditionner en indiquant la date de fabrication.
Formule des dilueur de congélation
| Base des 2 dilueurs = INRA-Hepes 20 mMol=
1 volume de solution saline-Hepes 20 mMol + 1 volume de lait écrémé |
| 1er dilueur = INRA 82-Hepes + 2% de jaune d’œuf (centrifugé) |
| 2ème dilueur = INRA 82-Hepes + 2% de jaune d’œuf (centrifugé)
+ 2,5% de glycérol |
2 Préparation des doses de sperme frais
21 Méthode standardisée à 200 millions de spermatozoïde
Les doses préparer contiennent 200 millions de spermatozoïdes dans 10 ml de dilueur
Le conditionnement se fait en tubes de 10 ml ou en seringue de 20 ml. Pour ralentir les variations de température, les tubes de 10 ml sont placés dans des tubes de 50 ml (tubes « air ») et les seringues sont mises dans des manchons de mousse isotherme (seringues « manchon »).
L’insémination est dite « immédiate » si la mise en place à lieu dans les 30 minutes qui suivent la collecte. La dose sera conservée en seringue manchon ou dans le flacon en vrac à température ambiante.
L’insémination est dite « différée » si la mise en place à lieu dans les 8 heures qui suivent la récolte. La dose sera conservé à 4°C jusqu’à l’insémination.
22 Méthode sans perte de sperme
L’avantage de cette méthode est sa simplicité de réalisation et l’utilisation de toute la semence disponible. En revanche, le sperme n’est pas assez dilué pour permettre une bonne conservation : les IA doivent être immédiates.
- – Récolte et filtration de la semence identique à la première méthode.
- -Mesure de la concentration (C).
- – Estimer le volume (V) de sperme filtré obtenu dans le flacon gradué (biberon), en déduire le nombre total de spermatozoïdes (N = V * C).
– Effectuer les deux vérification suivantes :
*le nombre de spermatozoïdes par jument supérieur à 200 millions.
*la concentration est supérieure à 30 millions/ml (sinon le volume à inséminer dépassera 20 ml ; préférer la monte naturelle ou la récolte à vagin ouvert).
- – Rajouter 2 fois le volume V de Dilueur.
- – Calculer le volume (V) se sperme diluer dans chaque dose (3 * V/ nombre de juments à inséminer).
- – Remplir les seringues comme pour la méthode standardisée- préparation en vrac jusqu’à la graduation v ou jusqu’à 20 ml maximum ( si v > 20ml). L’utilisation de tout l’éjaculât ne doit pas dépasser un volume inséminé de 20 ml qui nuirait à l’intégrité de l’utérus.
23 Microbisme des doses de sperme congelé
Les doses d’IA sont 100 fois moins contaminées que le sperme pur (7000 versus 500 000 germes/ml).
La contaminations de la dose congelée n’est pas reliée à celle de la semence pure. La centrifugation du sperme dilué à 600 g pendant 10 mn éliminerait la majeure partie des bactéries qui restent dans le surnageant après centrifugation et sont éliminées avec le plasma séminal. Ceci expliquerait la forte diminution de la concentration en germes du sperme congelé par rapport au sperme pur, ainsi que l’absence de relation entre la concentration en germes du sperme congelé par rapport à celle de l’éjaculât dont il est issu.
La nature des germes présents dans le sperme congelé ressemble à celle du sperme éjaculé à l’exception des streptocoques et des staphylocoques qui sont pratiquement absents car tués par la congélation.
En revanche, l’agent de la Métrite Contagieuse, Taylorella equigenitalis, résiste parfaitement à la congélation
Par Isabelle PIQUEE, agronome : mémoire d’étude.